CCK-8 細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒- cck8法檢測(cè)細(xì)胞活力

貨號(hào)	規(guī)格
BDXB0002-5	5ml
BDXB0002-10	10ml
BDXB0002-30	30ml

產(chǎn)品概述

       CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一種基于WST（水溶性四唑鹽，一種類似于MTT的化合物）的細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒，用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)。在電子耦合試劑存在的情況下，WST被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的甲臜染料（formazan），甲臜染料直接溶解在培養(yǎng)基中。細(xì)胞增殖越多越快，則培養(yǎng)基的顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，生成甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。
 
用途
       用于生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物的篩選、細(xì)胞增值的測(cè)定、細(xì)胞毒性檢測(cè)以及藥敏等與細(xì)胞活性和增殖相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。本試劑盒使用方便，試劑盒包含一管已經(jīng)配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即開即用，無需其他準(zhǔn)備步驟。檢測(cè)過程也無需采用額外的步驟去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶標(biāo)儀上檢測(cè)，適合大規(guī)模，高通量的樣品檢測(cè)。

CCK-8與MTT法的比較


CCK-8法	MTT法
還原后的甲臜是水溶性的（不需要溶解）	還原后的甲臜是非水溶性的（需要加有機(jī)溶劑溶解）
重現(xiàn)性好	重現(xiàn)性差
操作簡(jiǎn)單	操作繁瑣
測(cè)定波長(zhǎng)：450-490nm	測(cè)定波長(zhǎng)：550-600nm
單一溶液，即開即用	需要加有機(jī)溶劑，有毒性




參考數(shù)據(jù)：

（1）CCK-8與MTT、XTT、MTS試劑盒比較圖

（2）博奧龍CCK-8與其它公司產(chǎn)品比較圖


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使用方法

 一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）

 1. 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。

2. 按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè) 細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。 

3. 接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD值，制作出 一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未 知樣品的細(xì)胞數(shù)量（適用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，尤其加入CCK-8后的 培養(yǎng)時(shí)間要一致）。

二、細(xì)胞活性檢測(cè) 1. 在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μl/孔）。

1.將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5% CO2）。

2. 向每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD的讀數(shù)）。 

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。 

4. 用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。 

5. 如果暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μl的0.1M的HCl溶液或1% w/v SDS溶液， 并遮蓋培養(yǎng)板避光室溫保存，24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。 

三、細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)（以96孔板為例） 

1. 在96孔板中配置100μl的細(xì)胞懸液（通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100μl約2000個(gè)細(xì)胞，細(xì) 胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100μl約5000個(gè)細(xì)胞。具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的 大小、細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定）。按照實(shí)驗(yàn)需要，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。 

2. 向培養(yǎng)板加入1-10μl不同濃度的待測(cè)藥物刺激。

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（后面有具體細(xì)胞的建議時(shí)間，例如：6、12、 24或48小時(shí)）。

4. 每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD讀數(shù)）。如果起 始的培養(yǎng)體積為200μl，則需加入20μl CCK-8溶液，其他情況以此類推?？梢杂眉恿讼?應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作空白對(duì)照。如果擔(dān)心所使用的藥物 會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作 為空白對(duì)照。 

5. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)（對(duì)于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以）。時(shí)間的長(zhǎng)短根 據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等情況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2 和4小時(shí)候分別 用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 

6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度?？梢允褂么笥?00nm的波長(zhǎng)，例如650nm，作為參 考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。 

7. 如果暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液， 并遮蓋培養(yǎng)板避光室溫保存，24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。 

注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化或還原特性，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（先用培養(yǎng) 基洗滌細(xì)胞兩次），去掉藥物影響。如果藥物影響比較小，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣 除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。 

活力計(jì)算

 細(xì)胞活力*（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0 加藥）-A（空白）] ×100 A

（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度 A

（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度 A

（0 加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 *細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力 

注意事項(xiàng)

1. 由于使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意蒸發(fā)的問題。一方面， 由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養(yǎng) 液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。 

2. CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性原理是通過檢測(cè)活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)。任何待測(cè)體系中存在還原劑，例一些抗氧化劑會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)法去除。

3. 建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

 4. 建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK試劑時(shí)，建議斜貼著培 養(yǎng)板壁加，不要查到培養(yǎng)基液面下加樣，溶液產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD讀數(shù)。

 5. 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1000個(gè)/孔（100μl培養(yǎng)基）。檢測(cè) 白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2500個(gè)/孔（100μl培養(yǎng)基），且培 養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)一些。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，需先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照 每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。 

6. 加入CCK-8溶液時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色已變化或pH值變化，建議換 用新鮮的培養(yǎng)基。 

7. 如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在450-490nm之間的濾光片，但是450nm濾 光片的檢測(cè)靈敏度。

8. 酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測(cè)定無明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過 扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

9. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。