與所有其他基因組模式一樣，CRISPR/Cas 基因療法必須以高效且對(duì)患者友好的方式實(shí)施。然而，當(dāng)前的基因遞送方法已出現(xiàn)脫靶效應(yīng)而且缺乏有效的敲除效率。

本次內(nèi)容中，來自圖賓根大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究所的 Pietro De Angeli 博士和 the Princess Maxima Center的Maarten 博士討論了 CRISPR/Cas 9 遞送方法的安全性，以及涉及可擴(kuò)展性和人工智能 (AI) 方法使用的當(dāng)前趨勢(shì)。

01 聚焦安全性特性：CRISPR/Cas 遞送中的 DNA、mRNA 和 RNPs

為了讓 CRISPR/Cas9 基因編輯無縫工作，復(fù)合體必須到達(dá)細(xì)胞核以便能夠定位目標(biāo)基因。

CRISPR 遞送由質(zhì)粒 DNA（pDNA）、mRNA 或核糖核蛋白 （RNPs） 介導(dǎo)，前兩者對(duì)安全性造成挑戰(zhàn)。通過質(zhì)粒 DNA 或 mRNA 遞送通常會(huì)觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，而 pDNA 并入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)增加，從而導(dǎo)致長期的不良影響。盡管體外策略可以預(yù)測(cè)和減輕這些風(fēng)險(xiǎn)，但 CRISPR/Cas9 的特異性問題仍未解決。

CRISPR/Cas9 機(jī)制。通過先結(jié)合導(dǎo)向 RNA，再結(jié)合緊挨在 3-核苷酸 PAM 序列之前的匹配基因組序列來激活 Cas9 酶。然后，Cas9 酶會(huì)引起雙鏈斷裂，并通過非同源末端連接 (NHEJ) 或同源定向重組 (HDR) 途徑修復(fù) DNA，從而形成編輯后的基因序列。

為了降低基因編輯的風(fēng)險(xiǎn)，科學(xué)家們正在轉(zhuǎn)向 RNP，RNP 由 Cas9 蛋白與靶向 gRNA 復(fù)合而成。這種遞送方法提供了更優(yōu)的特異性和安全性。Maarten 指出迄今為止，復(fù)合物在宿主內(nèi)的時(shí)間與 CRISPR/Cas9 基因編輯的精確度之間呈負(fù)相關(guān)：“mRNA 或 DNA 需要長達(dá)一周的時(shí)間來進(jìn)行 Cas9 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而 RNP 一旦進(jìn)入細(xì)胞核就立即開始工作，并在不到 24 小時(shí)內(nèi)完成任務(wù)。Cas9 在細(xì)胞核中停留的時(shí)間越長，就越有可能找到并積累脫靶位點(diǎn)。這就是為什么安全的基因編輯方法是通過 RNP 提供非常短暫的 Cas9 脈沖。”Pietro 補(bǔ)充說，RNPs 的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是易于優(yōu)化。“當(dāng)使用 RNPs 時(shí)，更容易調(diào)整試劑的濃度，這會(huì)影響目標(biāo)效率。而在基于 DNA 的 CRISPR 遞送中，很難預(yù)測(cè)和微調(diào)轉(zhuǎn)染效率和 DNA 拷貝數(shù)。”

基于 DNA 或 mRNA 的 CRISPR/Cas9 面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是，它可能會(huì)改變宿主的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組特征。這種轉(zhuǎn)變主要發(fā)生于宿主為 DNA 和 mRNA 形式的轉(zhuǎn)錄和翻譯重新組織其能量資源。由此產(chǎn)生的代謝負(fù)荷會(huì)擾亂宿主代謝，從而改變轉(zhuǎn)錄組和蛋白酶體。相比之下，作為 RNP 的 CRISPR/Cas9 遞送是一個(gè)可以發(fā)揮作用并進(jìn)行所需基因編輯的復(fù)合體，因此不會(huì)導(dǎo)致基因組向表達(dá) Cas9 的方向轉(zhuǎn)變。

02 體外應(yīng)用：探索 CRISPR 的可擴(kuò)展性和可行性

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)不能作為裸復(fù)合體遞送到細(xì)胞核中，因此適當(dāng)?shù)?CRISPR 遞送載體在保護(hù)復(fù)合體完整性方面起著重要作用。為了解決當(dāng)前的問題，科學(xué)家們分享了來自研究實(shí)驗(yàn)室的開創(chuàng)性工作。

麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的博德研究所副主席 David Liu，他設(shè)計(jì)了病毒源的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），可以包裹這種復(fù)合物。LNPs 在所有形式的 CRISPR/Cas9 中都展示出了高效的遞送效果，包括預(yù)先形成的 RNP。這種機(jī)制將復(fù)合物的遞送引導(dǎo)到特定相關(guān)的器官（Banskota 等人，2022，Cell 185，250–265）。與此同時(shí)，Jennifer Doudna 的實(shí)驗(yàn)室通過在蛋白的 C 端和 N 端添加核酸定位信號(hào)來增強(qiáng) Cas9 的位點(diǎn)特異性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在小鼠大腦中進(jìn)行精確的基因編輯（Stahl EC等人，Mol Ther. 2023年8月2日；31(8):2422-2438）。

雖然遞送方法不斷改進(jìn)，但 CRISPR/Cas9 基因編輯的臨床潛力尚未實(shí)現(xiàn)，主要是因?yàn)榕c長時(shí)間脫靶編輯相關(guān)的病毒遞送仍然是金標(biāo)準(zhǔn)。在非病毒遞送方法中，電穿孔因其與 RNPs 兼容的安全可靠的遞送能力脫穎而出。這種方法在細(xì)胞膜上穿孔，允許 RNP 無縫進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并防止其內(nèi)吞或逃逸。

在可擴(kuò)展性方面，又出現(xiàn)了一系列問題。雖然 Cas9 核酸內(nèi)切酶可以大批量生產(chǎn)且成本低，而 gRNA 不僅對(duì)疾病或治療方法具有特異性，而且對(duì)個(gè)體也具有特異性。Pietro 認(rèn)為，gRNA 規(guī)?；牡缆烦錆M了風(fēng)險(xiǎn)。

“目前，我認(rèn)為問題不在于技術(shù)本身，而在于法律框架。大型制藥公司更關(guān)注更常見的疾病，因?yàn)樗麄冊(cè)趯ふ疑虡I(yè)上可行的機(jī)會(huì)。屬于這一群體的患者更有可能接受基因編輯治療。對(duì)于罕見病的治療，學(xué)術(shù)和非營利研究機(jī)構(gòu)必須努力為患者提供便利。”據(jù) Maarten 說，罕見疾病的監(jiān)管程序必須有所不同 “對(duì)于每種疾病，都必須通過大量的體外數(shù)據(jù)來證明復(fù)合物的安全性。對(duì)于全球患者數(shù)量有限的罕見疾病，生成這樣全面的報(bào)告是不可能的。“目前，Jennifer Doudna 和其他 CRISPR 專家發(fā)起的倡議正在與 FDA 協(xié)商，以放寬對(duì)罕見疾病的臨床前數(shù)據(jù)要求和 IND 備案。”該提案涉及使用體外基因編輯來生成編輯后的細(xì)胞，然后重新注入患者體內(nèi)，從而使基因組編輯被視為一種試劑而非藥物。”

03 增強(qiáng) CRISPR 精準(zhǔn)醫(yī)療：CRISPR/Cas 與 AI 及 ML 的協(xié)同作用

機(jī)器學(xué)習(xí)（ML）和人工智能（AI）工具——類似于它們?cè)谄渌S多領(lǐng)域中發(fā)揮的作用一樣——被認(rèn)為是基因編輯和基因驅(qū)動(dòng)藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的變革者。就 CRISPR/-Cas9 而言，它們可用于組裝位點(diǎn)特異性和脫靶編輯的大型數(shù)據(jù)集，并將這些數(shù)據(jù)集與不同的堿基編輯器或 3D RNP 結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)。機(jī)器學(xué)習(xí)算法可以針對(duì)特定基因給出所需的 gRNA 序列，并且實(shí)現(xiàn)特異性水平所需的蛋白質(zhì)層面上的所有修飾。因此，科學(xué)家現(xiàn)在可以設(shè)計(jì)最安全、最有效的 gRNA。

AI 工具還被用于預(yù)測(cè)進(jìn)化程度更高的 CRISPR/Cas9 變異體的療效。為了改進(jìn)引物編輯，研究人員開發(fā)了 nCas9 (融合為逆轉(zhuǎn)錄酶的 Cas9 nickase) 以簡化各種基因組編輯類型，如點(diǎn)突變、插入和缺失。雖然這一新型系統(tǒng)在理論上能提供更好的初始編輯效率，但其設(shè)計(jì)和安全性必須得到全面評(píng)估，這正是 AI 工具預(yù)測(cè)能力發(fā)揮作用的地方。Maarten 再次強(qiáng)調(diào)了 AI 在基于基因的藥物發(fā)現(xiàn)中的價(jià)值：“它幫助我們掃描數(shù)百種 Cas9-gRNA 組合，以檢測(cè)出表現(xiàn)優(yōu)秀的前 10 種組合。”

04 CRISPR 的未來：改變治療方法

傳統(tǒng)的基因組測(cè)序不足以闡明疾病的遺傳背景。雖然研究人員可以從一名患者中分離細(xì)胞，并將這些基因組與健康的基因組進(jìn)行比較，但這種比較并不一定能涵蓋導(dǎo)致疾病表型的數(shù)千個(gè)點(diǎn)突變。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)有助于克服這些障礙，并極大地受益于詳細(xì)的疾病建模和針對(duì)特定突變的個(gè)性化醫(yī)療。對(duì) Pietro 來說，治療只是問題的一方面，“我們不僅可以將 CRISPR/Cas9 用作治療工具，還可以將其用作疾病研究的手段。3D 細(xì)胞模型，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生的類器官，這對(duì)于模擬復(fù)雜的人類生物學(xué)極為寶貴。因此，通過在 iPSC 基因組中引入與疾病相關(guān)的突變，我們可以生成能夠分化為疾病表型的細(xì)胞培養(yǎng)物。” CRISPR/Cas9 的這一方面值得關(guān)注，因?yàn)榧膊〉倪z傳背景對(duì)開發(fā)強(qiáng)有力的治療工具至關(guān)重要。

當(dāng)然，3D 細(xì)胞建模的作用也不可高估。通過 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和 CRISPR/Cas9，研究人員可以生成等基因細(xì)胞模型，該模型僅包含從少數(shù)患者提取的細(xì)胞的整個(gè)基因組景觀。

結(jié)論 — CRISPR 研究與應(yīng)用的未來

CRISPR/Cas9 開啟的治療機(jī)會(huì)是廣闊的，特別是在體外編輯點(diǎn)突變和基因修復(fù)方面以及在未來的體內(nèi)修復(fù)方面。這可以增加攜帶既往難以靶向突變的罕見疾病患者的治療機(jī)會(huì)。

值得注意的是，CRISPR 并不是一個(gè)萬能的解決方案。特別是當(dāng)談到癌癥時(shí)，它并不能否定化療方法的價(jià)值。相反，它可以通過深入探究疾病的基因組根源來產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，而藥物復(fù)合物則在化學(xué)酶水平上抑制與疾病相關(guān)的機(jī)制。將 CRISPR 與 FDA 批準(zhǔn)的藥物相結(jié)合，可以加速其在主流臨床癌癥治療應(yīng)用中的普及。

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參考文獻(xiàn)

Banskota等人，2022，《Cell》185，250–265
Stahl EC等人，Mol Ther. 2023年8月2日；31(8):2422-2438