對于剛接觸分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的小伙伴們來說，如果做一些與基因相關(guān)的實(shí)驗(yàn)的話，肯定離不開最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)——PCR，目前大家使用PCR技術(shù)做的最多的就是對基因/物種的鑒定、基因的克隆、基因表達(dá)量測定等實(shí)驗(yàn)。今天百奧創(chuàng)新將介紹PCR引物設(shè)計(jì)要遵循什么原則。
1、引物長度一般在15-30bp。常用的為18-27bp，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)；

2、引物GC含量一般為40%-60%， 45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超過5℃。

3、引物所對應(yīng)的模板序列的Tm值在55-80℃之間，最好為72℃左右。

4、引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾，且 3’端的堿基一般不用A；引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗，

5、堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。

6、盡量在基因的編碼區(qū)（CDS序列）上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增。

7、使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性。

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