錢美圓，徐波
應(yīng)用技術(shù)研究中心
近日，三泰科技制備純化實驗室的純化工程師小錢接到某制藥公司委托的樣品制備純化任務(wù)，需要對某極性很大且難溶于水的樣品進(jìn)行制備純化?；跇悠返男再|(zhì)，小錢首先想到了正相分離模式，但是經(jīng)過小量樣品的純化預(yù)實驗后，小錢發(fā)現(xiàn)樣品在正相分離柱上保留太強(qiáng)以至于很難洗脫下來，看來正相模式是行不通了。
沒關(guān)系，還可以嘗試反相分離模式，于是小錢稱取了50 mg樣品，溶于5 mL乙腈/甲醇/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超聲加熱使樣品*溶解，然后根據(jù)樣品的HPLC分析條件設(shè)置好洗脫梯度，并根據(jù)實際制備分離過程中的出峰情況實時調(diào)整梯度設(shè)置，制備純化的實驗條件如表1所示。
表1. 小量樣品制備純化實驗參數(shù)設(shè)置
圖1. 小量樣品的制備分離圖譜
制備分離圖譜如圖1所示，從預(yù)實驗的分離結(jié)果來看，目標(biāo)產(chǎn)物可以與雜質(zhì)有效的分離，且分離度較高，可以滿足目標(biāo)物和雜質(zhì)分別收集的需求。于是，小錢接下來進(jìn)行了放大實驗，她將1 g樣品溶于50 mL甲醇/乙腈/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超聲加熱使樣品*溶解，然后設(shè)置好制備純化實驗的參數(shù)，如表2所示。
表2. 樣品量放大后的制備純化實驗參數(shù)設(shè)置
圖2. 樣品量放大后的制備分離圖譜
制備分離圖譜如圖2所示，分析圖譜可知，在上樣量放大20倍后，所用分離柱放大了相應(yīng)的比例，但由于樣品的溶劑問題使分離結(jié)果與預(yù)期不符。因DMF在紫外檢測波段有強(qiáng)吸收，會干擾樣品的檢測，因此在配置樣品溶液時使用了高比例的甲醇和乙腈。在此條件下大體積上樣時形成了體積過載，因此大量樣品隨著洗脫溶劑很快就被洗脫出來，未能獲得有效的保留和分離。此外，由于330 g純化柱有效柱床高度相比25 g純化柱沒有成比例的增加，因此前者的柱效相比后者下降較多，這也導(dǎo)致了分離圖譜中目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)未能有效分離。小錢在與同事們討論后，決定只好放棄一步到位的想法，利用DMF溶劑溶解少量樣品后，分多次對樣品進(jìn)行制備純化。
小錢稱取了600 mg樣品，溶于6 mL DMF中，超聲加熱使樣品*溶解后，開始進(jìn)行樣品分離純化實驗，實驗參數(shù)設(shè)置如表3所示。
表3. 改進(jìn)后的放大制備純化實驗參數(shù)設(shè)置
圖3. 改進(jìn)后的樣品制備分離圖譜
小錢利用相同的實驗參數(shù)設(shè)置，對總計6.5 g樣品進(jìn)行了多次進(jìn)樣，圖3所示為其中兩次的樣品制備分離圖譜。分析圖譜可知，在減小樣品進(jìn)樣體積后，樣品得到了有效的分離純化，目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)分離度良好，且分離重現(xiàn)性不錯。經(jīng)HPLC分析，純化后收集的目標(biāo)產(chǎn)物純度為98.4%，回收率89.4%，雜質(zhì)純度為88.1%，回收率74.8%，樣品分離前后的HPLC分析圖譜如圖4所示。
圖4. 分離前樣品、分離純化后得到的目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的HPLC分析圖譜
總結(jié)這個樣品制備純化案例，在對此類具有很大極性同時又難溶于水的樣品進(jìn)行分離純化時，可以參考本案例中的思路，即采用少量有機(jī)相溶劑對樣品進(jìn)行溶劑后，分多次進(jìn)樣，進(jìn)而完成全部樣品的制備純化。三泰科技出品的SepaBeanTM machine配合SepaFlash系列反相純化柱，可以為用戶提供快速的樣品制備純化解決方案，助力實驗室研究人員輕松完成各類樣品純化任務(wù)。
