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閱讀：139發(fā)布時(shí)間：2024-7-13
海水浮游植物色素測定
萃取熒光法(葉綠素a)
方法原理
葉綠素a的丙酮萃取液受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生紅色熒光,過濾一定體積海水所得的浮游植物用90%丙酮提取其色素,使用熒光計(jì)測定提取液酸化前后的熒光值,計(jì)算出海水中葉綠素a的濃度。
主要儀器設(shè)備
a)熒光計(jì) :激發(fā)光波長450 nm,發(fā)射光波長685 nm;
b) 抽濾裝置:包括濾器、支架、抽濾瓶和真空泵;
c)玻璃纖維濾膜:其截留效率相當(dāng)于0.65μm孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜;
d) 冰箱。
試劑
體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酮、體積分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸、碳酸鎂溶液p(MgCO:)=10g/dm2。
測定步驟
熒光計(jì)校準(zhǔn)校準(zhǔn)頻率
至少每半年一次。
標(biāo)準(zhǔn)葉綠素 a溶液(ρ=1 mg/dm3 )制備
過濾一定量的生長良好、處于指數(shù)生長前期的培養(yǎng)硅藻,用90%丙酮提取其葉綠素a,或者用90%丙酮溶解一定量的市售葉綠素a結(jié)晶,濃度大約為p=1 mg/dm'。
標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a溶液濃度標(biāo)定
使用分光光度計(jì)正確測定標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a溶液的濃度。.
葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制
用上述標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a溶液配制濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,供各量程檔校準(zhǔn)用。
換算系數(shù) Fs的測定
上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在不同量程檔上進(jìn)行酸化前后熒光值的測定。各量程檔的換算系
采樣過濾 .
采樣后,應(yīng)盡快過濾。過濾海水的體積視調(diào)查海區(qū)而定,富營養(yǎng)海區(qū)一般可過濾50 ~100 cm3 ;
中營養(yǎng)海區(qū)過濾200 cm°~500 cm3 ;寡營養(yǎng)海區(qū)可過濾500 cm°~1 000 cm"。過濾時(shí)抽氣負(fù)壓應(yīng)小于50 kPa,。
濾膜保存
過濾后的濾膜應(yīng)在1h內(nèi)提取,若無條件提取測量,可將濾膜對折,用鋁箔包好,存放于低溫冰箱(-20C),保存期可為60 d或放人液氮中保存期可為一年。
提取
將載有浮游植物的濾膜放人加有10 cm8體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮的提取瓶內(nèi),蓋緊,搖蕩,立即放于低溫(0C)冰箱內(nèi),提取12 h~24 h。
熒光測定.
測定步驟如下:
a) 取出樣品放在室溫、黑暗處約0.5 h,使樣品溫度與室溫一致;
b)每批樣品測定前后,以體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮作對比液,測出各量程檔的空白熒光值Fo和Fo2;
c)將提取瓶內(nèi)，上清液倒人測定池中,選擇適當(dāng)量程檔,測定樣品的熒光值R;
d) 加1滴體積分?jǐn)?shù)為10%鹽酸于測定池中,30 s后測定其熒光值R。;
e) 將結(jié)果記錄于表。
分光光度法(包括葉綠素a.b和c)
方法原理
葉綠素a、b、c的丙酮萃取液在紅光波段各有一吸收峰。一定體積海水中的浮游植物經(jīng)濾膜濾出,用90%丙酮提取其葉綠素,應(yīng)用分光光度計(jì)測定,根據(jù)三色分光光度法方程,計(jì)算海水中葉綠素a、b.c的濃度。
試劑
碳酸鎂溶液:p( MgCO3)= 10 mg/dm' ;體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酮。
主要儀器設(shè)備
主要儀器設(shè)備有以下幾種:
a)分光光度計(jì):波長必須準(zhǔn)確,波帶寬度≤2nm,消光值可讀到0.001;
b)抽濾裝置:見5.2.1.2 b);
c)濾膜:截留 效率相當(dāng)于0.65 μm孔徑的聚碳酸酯核孔濾膜或玻璃纖維濾膜、纖維素酯微孔濾膜或其他濾膜;
d)貯樣干燥器、研磨器、離心機(jī).具塞離心管和冰箱。
測定步驟
采樣過濾
采樣后應(yīng)盡快過濾。將濾膜置于濾器上,加5cm°碳酸鎂溶液,接著過濾海水樣,過濾時(shí)負(fù)壓應(yīng)小于50kPa。過濾海水體積視調(diào)查水域而定,近岸水取0.5dm'~2dm3,外海水取5dm*~10dm'。
保存
過濾后的樣品應(yīng)立即研磨提取。若條件不允許,可將濾膜對折兩次,置于貯樣干燥器內(nèi)低溫(<- 20C )黑暗保存,期限最長兩個(gè)月。
研磨
將載有浮游植物的濾膜放人研磨器,加2cm2或3cm3體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酮，研磨,后將樣品移入具塞離心管中,研磨器用體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮洗滌2次或3次,洗滌液一并倒人離心管中,但總體積不
能超過10 cm23
提取
將具塞離心管置于低溫黑暗處提取30min。
離心
提取液于4000 r/min 條件下離心10 min,上清液倒人刻度試管中,并定容為10 cm°或15 cm"。
測定
將提取液注人光程為1 cm~10 cm的比色槽中，以體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮作空白對照,用分光光度計(jì)測定波長為750 nm、664 nm、647 nm、630 nm處的溶液消光值。測定結(jié)果記錄于表。
消光值選擇
作濁度校正的750 nm處消光值不超過每厘米光程0. 005,664 nm處消光值在0. 1~0.8之間。
高效液相色譜(HPLC)法
方法原理
浮游植物所含各種光合色素經(jīng)提取后,在一定溶劑系統(tǒng)中,可經(jīng)高效液相色譜柱進(jìn)行分離,再由檢測器檢測并獲得色譜圖。根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)色素比較保留時(shí)間及色譜圖可鑒別色素種類,根據(jù)色譜峰的面積可計(jì)算含量。
主要儀器設(shè)備
a) 高效液相色譜儀:包括溶劑流動相系統(tǒng)、高壓泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、計(jì)算機(jī)等;
b)抽濾裝置、玻璃纖維濾膜、液氮罐、超聲波粉碎器和離心機(jī)等。
試劑
丙酮、水、甲醇.乙腈和乙酸乙酯(均為色譜純);醋酸銨;BHT(2,6-二叔丁基對甲酚)、角黃素。
測定步驟
采樣過濾
采樣后,應(yīng)盡快過濾,視海水中浮游植物數(shù)量,過濾0.5 dm°~4 dm’海水(貧營養(yǎng)海區(qū)3 dm3 ~4 dm3 ,中等營養(yǎng)海區(qū)1 dm*~2 dm2 ,富營養(yǎng)海區(qū)0.5 dm°~1 dm' ),過濾時(shí)使用孔徑為0.65 μm、直徑為25mm的玻璃纖維濾膜，抽濾負(fù)壓不超過50kPa,并注意避光。
保存
過濾后,如不能立即提取，濾膜應(yīng)保存在液氮罐中。在放入液氮或超低溫冷凍之前,冷凍保存(-20C)不能超過20h。濾膜可用預(yù)先標(biāo)記好的鋁箔包裹保存。
萃取
將濾膜從液氮中取出,解凍約1min,放人玻璃離心管中,加入3cm290%丙酮,再加入50mm'角黃素作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物(角黃素亦可預(yù)先加在提取溶劑丙酮中)。用體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮提取一張玻璃纖維濾膜作空白樣?；旌衔镉贸暡ǚ鬯?/span>(50 W, 30s),然后在0C條件下提取24 h。分析前將提取物混勻后離心去除細(xì)胞殘屑,并用載有聚四氯乙烯濾膜(直徑13mm,孔徑0.2μm)的注射式濾器過濾。
高效液相色譜測定
HPLC系統(tǒng)準(zhǔn)備
a)高壓進(jìn)樣閥(帶有 200 mm'樣品環(huán));
b) C-18保護(hù)柱(50 mmX4.6 mm);
c) 反相C-18色譜分析柱(250 mmX4.6 mm);
d) 紫外-可見吸收檢測器(測定波長為436 nm和450 nm);
e)配有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件的計(jì)算機(jī);
f) HPLC溶劑:
溶劑A:甲醇: 0.5 mol醋酸銨(80 : 20)，0.01%BHT;
溶劑B:乙腈:水(87.5: 12.5), 0.01%BHT;
溶劑C:乙酸乙酯。
以上溶劑均用色譜純,使用前以0.45pum濾膜過濾。
操作步驟
a) 用溶劑A建立并平衡HPLC系統(tǒng)1 h,流量為1 cm2 /min;
b)根據(jù)所測樣 品的濃度范圍,每種色素準(zhǔn)備至少5個(gè)濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)液，并以該標(biāo)準(zhǔn)液校正
HPLC系統(tǒng);
c)取每種工作標(biāo)準(zhǔn)液1000mm3,以300mm3蒸餾水稀釋,混勻并平衡5min,潤洗樣品注射器兩次,進(jìn)樣500mm2(樣品環(huán)體積的2.5倍);
d)色素樣品和空白樣的準(zhǔn)備及進(jìn)樣方法同標(biāo)準(zhǔn)液。注意進(jìn)樣時(shí)應(yīng)避免有氣泡,樣品間的進(jìn)樣間隔應(yīng)保持均勻。預(yù)先混有蒸餾水或其他溶劑的樣品不能滯留在自動進(jìn)樣器中,以免疏水性的色素從溶液中析出;
e) 進(jìn)樣后通過梯度洗脫程序(見表2)對葉綠素和類胡蘿卜素進(jìn)行分離,分析過程中通過氦氣或在線脫氣機(jī)對流動相溶液進(jìn)行脫氣;
f)根據(jù)比較色素樣品與標(biāo)準(zhǔn)的色譜峰的保留時(shí)間來鑒定樣品的色素種類,收集各洗脫峰可進(jìn)一步進(jìn)行分光確定;
g) 填寫表。
以上三種方法以萃取熒光法優(yōu)先
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