Equi-phi29 DNA Polymerase

商品屬性：

商品介紹：

是 phi29 的改造體，并經(jīng)多次純化分離而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的鏈置換、連續(xù)合成特性（>70kb）的基礎(chǔ)上，提高了滾環(huán)擴(kuò)增的反應(yīng)溫度，該酶酶可以在 42 度條件下持續(xù)的進(jìn)行 DNA 合成（而 phi29 DNA 聚合酶在此溫度下反應(yīng)活性很低）。

這種高溫的反應(yīng)特性，在以下幾個(gè)方面對(duì)實(shí)驗(yàn)有明顯的提升：

（1）在 NGS 測(cè)序中，其提升了高 GC 含量、回文結(jié)構(gòu)等復(fù)雜模板的延伸能力，使得 NGS 的覆蓋度更均一，降低測(cè)序所需深度；

（2）高溫的反應(yīng)條件，提升了基因組 DNA的 WGA 產(chǎn)物的合成量，并可以進(jìn)行變溫?cái)U(kuò)增；

（3）降低測(cè)序中 Gap 區(qū)域，提升單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量和完整度；

（4）降低非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；

（5）提升 MDA/RCA 等實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增性能和特異性。
除此外，該酶仍然具有很強(qiáng)的 3’→5’外切酶校讀功能，合成的 DNA 片段保真性高。該酶的外切酶活性較強(qiáng)，因此合成過程中引物需要 3’端硫代修飾，以降低外切活性對(duì)引物的切割效應(yīng)。

儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年。
注意：在不同的實(shí)驗(yàn)類型中，Oligo根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行選擇。
2. 引物和模板退火：體系配制完畢后，放置到 PCR 儀中，95℃ 3min，25℃ 3min。3. 退火完畢后，向退火產(chǎn)物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase，混合均勻。
4. 擴(kuò)增反應(yīng)
4.1 恒溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于環(huán)狀DNA模板采用恒溫反應(yīng)作為推薦使用30℃恒溫?cái)U(kuò)增，30℃孵育 6~16h.該酶在 30-42℃條件下均可工作，
必要時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型進(jìn)行調(diào)整。
4.2 變溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于基因組 DNA 或 cDNA 模板，推薦使用變溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，以在短時(shí)間內(nèi)獲得更高產(chǎn)量，并提高了低濃度模板的擴(kuò)增產(chǎn)量。在 PCR 儀上做如下設(shè)置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循環(huán) 72 次（約 6h）或 120次（約 10h）.必要時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，可于 65°C 10min 進(jìn)行失活反應(yīng)。
使用注意事項(xiàng)
（1）必要時(shí)可單獨(dú)額外添加終濃度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA，可提高反應(yīng)效率。
（2）該酶的最佳反應(yīng)溫度為 42 ℃ （在 30~42℃之間均有活性）。
（3）65℃ 10min 即可使該酶失活。
（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型需要，調(diào)整dNTP的濃度100~500 μM。
（5）添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 產(chǎn)量。
（6）反應(yīng)引物 3’端的硫代修飾可避免引物降解。

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