原代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟！
原代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟！
原代培養(yǎng)是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)離體時(shí)間短，遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似，適于做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等研究。較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
一、基本介紹
細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。
原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取組織或器官的一部分進(jìn)行培養(yǎng)，也稱(chēng)初代培養(yǎng)。嚴(yán)格地說(shuō)即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到次傳代階段，但實(shí)際上，通常把代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。由于培養(yǎng)的細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來(lái)，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段。同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。
原代培養(yǎng)的過(guò)程指動(dòng)物的組織或器官?gòu)臋C(jī)體取出后，經(jīng)機(jī)械法或各種酶類(lèi)（常用*）和鰲合劑（常用EDTA)處理，使之分散成單個(gè)細(xì)胞，加入適量培養(yǎng)基，置于合適的培養(yǎng)容器中，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定條件下，使之生存、生長(zhǎng)和繁殖的過(guò)程。
二、分類(lèi)
的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
⒈組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。
⒉分散細(xì)胞培養(yǎng)則是將組織塊用機(jī)械法或化學(xué)法使細(xì)胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性的游離細(xì)胞，經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶（如*和膠原酶）消化細(xì)胞間的結(jié)合物，或用金屬離子螯合劑（如EDTA）除去細(xì)胞互相粘著所依賴(lài)的Ca2+，再經(jīng)機(jī)械輕度振蕩，使之成為單細(xì)胞。
三、實(shí)驗(yàn)
⒈原理
將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用*）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱(chēng)原代培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來(lái)，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段，同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)加入的*藥物的敏感性來(lái)幫助選擇效的*方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。
⒉材料和用品
材料：胎鼠或新生鼠
儀器：培養(yǎng)瓶、*瓶、小玻璃漏斗、三角燒瓶、平皿、吸管、試管、移液管、無(wú)菌紗布、無(wú)菌*、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、蠟盤(pán)、科研、大頭針、離心管、75%酒精棉球。
藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)、小牛血清、0.125%*、Hanks液、75%酒精、雙抗(*和*)、2%碘酒。
儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺(tái)、磁力攪拌器、離心機(jī)。
附：Hank’s液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。
⒊實(shí)驗(yàn)步驟
以胚胎小鼠為例
⑴取材：將孕鼠拉頸椎處死，投入75%酒精浸泡數(shù)秒消毒，提出孕鼠控掉酒精，放置于蠟盤(pán)中用大頭針固定。用科研逐層分離皮膚和肌肉組織，打開(kāi)腹腔。注意不同的解剖層次使用不同的消毒器械。后取出雙角子宮置于無(wú)菌平皿內(nèi)。
⑵用Hanks液洗滌3次，剪開(kāi)子宮取出胚胎。除去子宮、血液和筋膜等組織。
⑶用彎頭剪把胚胎盡量剪碎，每個(gè)組織塊小于1mm3。在操作時(shí)應(yīng)盡量將平皿蓋半蓋住平皿以防空氣中塵埃落下污染組織。再用Hanks液洗滌2~3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。以下可按兩種方法進(jìn)行，即消化法和組織塊培養(yǎng)法。
⑷若使用消化法，則將組織塊放人三角燒瓶?jī)?nèi)加入10~30mL0.125%*，37℃磁力攪拌消化20多min。然后加人少量血清終止消化。用幾層無(wú)菌紗布過(guò)濾。取過(guò)濾液，800r/min離心5~10min收集細(xì)胞。棄上清，加入帶有雙抗的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
注：細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。
⑸若進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，則不做步驟4，加入幾滴血清于組織塊中，再用彎頭吸管將組織塊懸液吸起。在一小培養(yǎng)瓶中逐個(gè)鋪展開(kāi)，注意將瓶底涂抹均勻。將瓶子翻轉(zhuǎn)倒置后在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置2－3h。待組織塊微干與瓶壁粘牢后再輕輕將瓶子翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，從邊角加入4~5mL培養(yǎng)基，使細(xì)胞接觸到培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
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