使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于PCR 陽性對照。
參數(shù)規(guī)格：
產(chǎn)品名稱：轉(zhuǎn)基因構(gòu)建35S啟動子-GUS基因PCR試劑盒
貨號:CP97467
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品運輸：低溫運輸
產(chǎn)品保存：-20℃保存
產(chǎn)品有效期：一年
運輸：低溫
注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
PCR檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因為本領(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中所述待測目的基因為本領(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
?實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
以下是轉(zhuǎn)基因構(gòu)建35S啟動子-GUS基因PCR試劑盒公司正在熱銷的產(chǎn)品：
土霉素堿
砜霉素 15318-45-3
Thiamphenicol分子式：分子量：356.22
砜霉素 15318-45-3
Thiamphenicol分子式：分子量：356.22
砜霉素 15318-45-3
Thiamphenicol分子式：分子量：356.22
砜霉素 15318-45-3
Thiamphenicol分子式：分子量：356.22
D-青霉胺 52-67-5
D-Penicillamine分子式：C5H11NO2S分子量：149.21
2 ugpCold TFpCold TF低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCold-SUMOpCold-SUMO低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCP20pCP20低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCRE-LucpCRE-Luc低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCS2HApCS2HA低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCSA110pCSA110低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCSN44pCSN44低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCWoripCWori低溫運輸，-20℃保存
2 ugpCW-Cas9pCW-Cas9低溫運輸，-20℃保存
轉(zhuǎn)基因構(gòu)建35S啟動子-GUS基因PCR試劑盒R-脊椎蛋白2(RSPO2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
R-脊椎蛋白3(RSPO3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
R-脊椎蛋白4(RSPO4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白(S100)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白(S100)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
S100鈣結(jié)合蛋白(S100)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白Ⅵ(MYO6)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白ⅦA(MYO7A)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白ⅦB(MYO7B)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白ⅨA(MYO9A)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白ⅨB(MYO9B)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
肌球蛋白Ⅹ(MYO10)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 規(guī)格： 48T/96T
